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1 范围：本标准规定了医药工业无菌室和洁净区中浮游菌的测试条件和测试方法。

　　本标准适用于医药工业无菌室和洁净区，无菌室或局部空气净化区域(包括洁净工作台)的浮游菌的测试和环境的验证。

　　2 引用标准：GB/T 16293?2010

　　药品生产管理规范(1998修订)附录。

　　3 标准

　　4 测试方法

　　4.1 方法提要

　　本标本采用的方法是计数浓度法。即通过收集悬游在空气中的生物性粒子于专门的培养基(选择能证实其能够支持微生物生长的培养基)，经若干时间和适宜的生长条件下让其繁殖到可见菌落计数，以判定该洁室的微生物浓度。

　　4.2人员的职责及培训

　　无菌室的测试人员应进行本的培训并获得相应的资格后才能才能履行对无菌室测试的职责，其中包含涉及的卫生知识和基本的微生物知识。

　　无菌室的测试人员应选择与生产操作的空气洁净度要求相适应的穿戴方式，外面的衣服不能带进100000级以上的区域。

　　4.3 仪器、辅助设备和培养基

　　选择合适的浮游菌采样器，包括采用无油的抽气泵，较低的气流流速和较大的采样流量，以保证培养基表面的水分布被吹干。

　　本测试需要具备仪器、辅助设备和培养基如下：

　　a) 浮游菌采样器;

　　b) 培养皿;

　　c) 高压消毒锅;

　　d) 培养基;

　　e) 恒温培养箱;

　　4.4 浮游菌采样器原理

　　浮游菌采样器一般采用撞击法机理，可分为夹缝式采样器、离心式或针孔式采样器。夹缝式采样器由内部风机将气流吸入，通过采样器的夹缝式平板，将采集空气喷射并撞击到缓慢的平板培养基表面，附着的活微生物粒子经培养后形成菌落。离心式采样器由于内部风机的高速旋转，气流从才样器的前部进入后部流出，在离心力的作用下，空气中的活微生物粒子有足够的时间撞击到的固型培养条上，附着活的微生物粒子经培养后形成菌落。针孔式采样器是气流通过一个金属盖吸入，盖子上是密集的经过机械加工的特制小孔，通过风机将收集到的细小的空气直接撞击到平板培养基表面，附着的活物微生物粒子经培养成型后形成菌落。

　　4.5 测试要点

　　4.5.1 必须按照仪器的检定周期，定期对测试仪器作检定。应使用检定合格，并且使用有效期内的仪器。

　　4.5.2 测试仪器未进入被测区域时，若必需，则先清洗表面吧，或在相应的无菌室内准备和存放(用保护罩或其他适当地外罩保护仪器)。

　　4.5.3 在100级无菌室内用纸时，上面应蒙上一张透明不沾尘的覆盖物，在100级的无菌室内不能用铅笔的橡皮。

　　4.5.4 使用测试仪器时应严格按照说明书操作。

　　4.5.4.1 仪器开机，预热到稳定后，方可按说明书的规定对仪器进行校正，同时检查采样流量，并根据采样量设定时间。

　　4.5.4.2 采样口必须用使用便于消毒及化学性能稳定的材料制造。

　　4.5.4.3 采样管严禁渗漏，内壁应光滑。

　　4.5.4.4 采样管的长度应根据测点的高度定，尽量减少弯曲。

　　4.6 培养皿

　　4.6.1 一般采用φ90mm×15mm规格的培养皿。可根据所选用采样器选择合适的培养皿。

　　4.6.2离心式采样器采用的固型培养条

　　4.7 培养基

　　大豆酪蛋白琼脂培养基(罢厂础)或沙氏培养基(厂顿础)或其他用户认可并经验证的培养基。

　　4.8 恒温培养箱

　　必须定期对恒温培养箱进行效验

　　4.9 测试步骤;

　　4.9.1 测试前仪器、培养皿表面必须严格消毒。

　　4.9.1.1 采样器进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，用于100级无菌室的采样器

　　宜预先放在被测房间内。

　　4.9.1.2 用消毒剂擦净培养皿的外表面。

　　4.9.1.3 采样前，先用消毒剂消毒采样器的顶盖、转盘以及罩子的内外面，采样结束，再用消毒剂轻轻喷射罩子的内壁和转盘。

　　4.9.1.4 采样口及采样管，使用前必须高温灭菌。如用消毒剂对采样管的外壁及内壁进行消毒时，应将管中的残留液倒掉并晾干。

　　4.9.1.5 采样者应穿戴与被测洁净区域相应的工作服，在转盘上放入或调换培养皿前，双手用消毒剂消毒或带无菌手套操作。

　　4.9.1.6 采样仪器经消毒后先不放入培养皿，开启浮游菌采样器，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5min，并检查流量并根据采样量调整设定时间。

　　4.9.1.7 关闭浮游采样器，放入培养皿，盖上盖子。

　　4.9.1.8 置采样口于采样点后，开启浮游菌采样器进行采样。

　　4.10 培养

　　4.10.1 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。

　　4.10.2 采用大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)配制的培养经采样后，在30℃～35℃培养箱中培养，时间不得少于2d;采用沙氏培养基(SDA)配制的培养皿经采样后，在20℃～25℃培养箱中培养，时间不少于5d。

　　4.10.3每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。

　　4.11 菌落计数

　　4.11.1 用肉眼对培养皿上所有的菌落直接计数、标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。

　　4.11.2 若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。

　　4.12 注意事项

　　4.12.1 使用前应仔细检查每个培养皿质量，培养基及培养皿有变质、破损或污染的不能用使用的。

　　4.12.2 对培养基、培养条件及其他参数作详细记录。

　　4.12.3 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿面或真面仔细观察，不要有遗漏计培养皿边缘生长的菌落，并须要菌菌落或培养基沉淀的物区别，必要时用显微镜鉴别。

　　5 测试规则

　　5.1 测试条件

　　在测试之前要，要对无菌室相关参数进行预先测试，这类测试将会测试悬浮粒子的环境条件，例如：这种预先测试或可包括：

　　a) 温度和相对湿度的测试。 无菌室的温度和相对湿度应与其生产及工艺要求相适

　　应(无特殊要求时，温度控制在18℃～26℃，相对湿度控制在45%～65%之间为宜)。同时满

　　足测试仪器的使用范围;

　　b) 室内送风量或风速的测试的测试，或压差的测试;

　　c) 过滤器的泄漏测试

　　5.1 测试状态

　　静态和动态两种状态均可进行测试。

　　静态测试时，室内测试人员不得多于2人

　　浮游菌测试前,被测定无菌室(区)由用户决定是否需要预先消毒.

　　浮游菌测试时应标明测试时所采用的状态和室内测试人员数。

　　5.3 测试时间

　　5.3.1 在空态或静态a测试时，对单向流无菌室而言，测试宜在净化空气调节系统正常运行时间不少于10min后开始。对非单向流无菌室，测试宜在净化系统正常运行时间不少于30min后开始。在静态b测试时，对单向流洁净是(区)，测试宜在生产操作人员撤离现场并经过10min自净后开始;;对非单向无菌室，测试宜在生产操作人员撤离现场并经过20min自净后开始。

　　5.3.2 在动态测试时，则须记录生产开始的时间以及测试时间。

　　5.4.浮游菌浓度的计算

　　5.4.1采样点数量及其布置

　　5.4.1.1 少采样点数目

　　浮游菌的采样点位置可参照骋叠/罢16292-2010

　　补)工作区测点位置离地0.8～1.5尘左右(略高于工作面)。

　　产)送风口测点位置离开送风面30肠尘左右。

　　肠)可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。

　　5.4.2 小采样量

　　浮游菌每次小采样量见表1。

　　表1小采样量

　　5.4.3 采样次数

　　每个采样点一般采样一次。

　　5.4.4 采样注意事项

　　5.4.4.1 对于单向流无菌室或送风口，采样器采样口朝应正对气流方向;对于非单向流无菌室，采样口向上。

　　5.4.4.2 布置采样点时，至少应尽量避开尘粒较集中的回风口。

　　5.4.4.3 采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少走动。

　　5.4.4.4 采取一切措施防止采样过程的污染和其他可能对样本的污染。

　　5.4.4.5 培养皿在用于检查时，为避免培养皿运输或搬动过程造成的影响，宜同时进行阴性对照试验，每次或每个区域取1个对照皿，与采样皿同法操作但不得暴露采样皿，然后与采样后的培养皿(TSA或SDA)一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。

　　5.5 记录

　　测试报告中应包含以下内容

　　补)测试者的名称和地址，测试日期;

　　b) 测试依据

　　肠)试无菌室的平面位置(必要时标注相邻区域平面位置);

　　诲)有关测试仪器及其测试方法的描述：包括测试环境条件，采样点数目及布置图，测试次数，采样流量，或可能存在的测试方法的变更，测试仪器的检定证书等;若为动态测试，则还应记录现场操作人员数量及位置，现场运转设备和数量和位置;

　　别)结果：包括所有统计计算资料。

　　5.6 结果计算

　　5.6.1 用计数方法得出各个培养皿的菌落数。

　　5.6.2 每个测点的浮游菌平均浓度的计算，见式(1)。

　　平均浓度(个/m3)= 菌落数/ 采样量??????????????? (1)

　　例1：某测点采样量为400尝，菌落数为1，则：

　　平均浓度=1/0.4=2.5个/尘3

　　例2：某测点采样量为2尘3，菌落数为3，则：

　　平均浓度=3/2=1.5个/尘3

　　5.7 结果评定

　　5.7.1 每个测点的浮游菌平均浓度必须低于所选定的评定标准中对于细菌浓度的界限。

　　5.7.2 在静态测试时，若某测点的浮游菌平均浓度过评定标准，则应重新采样两次，两次测试结果均合格才能判为符合。

　　5.8 日常监控

　　对于浮游菌的监控，宜设定纠偏限度和警戒限度沿单一方向呈平行流线并且与气流方向垂直的断面上风速的气流，以保证无菌室的微生物浓度受到控制。应定期以检查微生物负荷以及消毒剂的效力，并非作倾向分析。静态和动态的监控都可以采用该方法。

　　对于浮游菌的取样频率次，如果出现下列情况应考虑应修改，在评估以下情况，也应确定其他项目的检测频次：

　　---------------连续过纠偏和警戒限度;

　　---------------停工时间比预计延长;

　　--------------生产期间，空气净化系统进行任何重大的维修;

　　--------------常操做记录放映出倾向性的数据;

　　--------------消毒规程的改变;

　　--------------生物污染等;

　　--------------当生产设备有重大维修或增加设备时;

　　--------------当无菌室结构区域分布有重大变动时。